Медицина \ Экспериментальная иммунология

Тетрадь для лабораторных работ по спецкурсу "Экспериментальная иммунология", страница 7

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6

дата

Экспериментальное исследование активности системы комплемента: модификации метода 50 %-го гемолиза

Методический материал

·  Наиболее широко используемым методом оценки функциональной активности системы комплемента является метод 50% гемолиза. Его суть сводится к тому, что исследуемый образец сыворотки крови в разных разведениях смешивают с гемолитической системой, представляющей собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к ним же. Иными словами, гемолитическая система - это суспензия комплексов антиген (эритроцит барана)  - антитело (антитела к эритроцитам барана) в желатин-вероналовом буфере с ионами кальция. При высоком содержании в тестируемом образце сыворотки крови комплемента уровень его активации на комплексах ангиген-антитело будет высок, а следовательно степень гемолиза эритроцитов будет значительна. Сравнивая пробирки с разным количеством внесенного образца сыворотки крови со стандартами - 100% и 50 % гемолизом, можно определить количество условных единиц 50% гемолиза классического пути активации системы комплемента  - СН50.

·  Для оценки активности альтернативного пути активации системы комплемента используют аналогичную систему. Но в данном случае гемолитическая система представлена суспензией эритроцитов кролика, чья цитоплазматическая мембрана содержит полисахариды - значимые активаторы альтернативного пути. Активность альтернативного пути активации системы комплемента выражается в условных единицах - АР50.

·  Для оценки активности отдельных компонентов комплемента дополнительно используются соответствующие реагенты - R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, RB, RD. Эти реагенты представляют собой сыворотку крови человека или морской свинки, из которой специальными физико-химическими методами элиминирован конкретный компонент комплемента, например R3 - это реагент для определения С3, т.е. сыворотка крови, в которой отсутствует С3. Определение активности отдельных компонентов комплемента предполагает добавление в реакционную смесь реагента, что вызывает лимитирование сборки мембраноатакующих комплексов только тем количеством компонента, которое присутствует в исследуемом образце. Активность каждого компонента выражается также в условных единицах 50%-го гемолиза, например С2Н50, С3Н50, С5Н50 и т.д.

·  При необходимости определить, по какому пути происходит активация комплемента в конкретном эксперименте используют определение анафилатоксинов, т.е. фрагментов компонентов комплемента с малой молекулярной массой. Эта процедура выполняется с помощью радиоиммунного анализа.

·  Иногда имеет значение иммунохимическое определение концентрации компонентов комплемента в образцах сыворотки крови. В этом случае используют реакции серологического метода, в частности простую радиальную иммунодиффузию по Манчини.

Задания

Протокол

1. Приготовьте гемолитическую систему по схеме: эритроциты баран 3 раза отмыть изотоническим раствором хлорида натрия. После последнего центрифугирования эритроциты ресуспендировать в желатин-вероналовом буфере GVB2+, концентрация эритроцитов по объему должна составить 3 %. Приготовьте такой же объем гемолитической сыворотки в утроенном титре и при постоянном помешивании добавьте к суспензии эритроцитов барана. Инкубируйте 30 минут при + 37 °С, 2 раза отмойте GVB2+, приготовьте из осадка сенсибилизированных эритроцитов суспензию с концентрацией эритроцитов 1,5 ´108/мл. Оптическая плотность гемсистемы на l = 412 нм должна составлять 1,0 (0,2 мл гемсистемы + 2,8 мл дист.).

2. Поставьте реакцию по следующей схеме:

№ пробирки

реагент (мкл)

тест-образец (мкл)

гемсистема (мкл)

GVB2+

(мкл)

d H2O

(мкл)

1

v

-

200

300

-

2

v

5

200

295

--

3

v

10

200

290

-

4

v

20

200

280

-

5

v

30

200

270

-

6

v

40

200

260

-

7

v

50

200

250

-

8

v

60

200

240

-

контроль

100 % лизис

-

-

200

300

спонтанный лизис

-

-

200

300

-

инкубация 30 минут  + 37 °С

во все пробирки добавить 1,0 мл охлажденного GVB2+

центрифугировать при 3000 об./мин 10 минут

определить оптическую плотность на 412 нм

3. Проведите расчет данных:

а) рассчитайте величину y= оптич.плотность оп.пробирки (1...8)/ оптич.плотность 100 %лизиса

б) для каждой пробирки рассчитайте y/(1 - y)

в) постройте график зависимости каждого показателя y/(1 - y) от объема исследуемой сыворотки

г) определите активность компонентов комплемента в исследуемом образце, учитывая разведение сыворотки крови
Скачать файл