В настоящее время существует большое количество различных методов иммунологической диагностики, к наиболее современным и высокоточным можно отнести такие, как иммуноферментный анализ, реакция иммунофлуоресценции, встречный иммуноэлектрофорез в полиакриламидном геле, иммуноблоттинг, полимеразно-цепная реакция. Своему появлению эти методы обязаны развитию представлений о механизмах иммунного ответа, кинетике иммунного взаимодействия антигенов и антител, пониманию ферментативных процессов, развитию генной инженерии и биотехнологии.
К сожалению стоимость проведения этих анализов достаточно высока из-за их высокой наукоёмкости и необходимости специального оборудования. Преимущественно их производство возможно только в специализированных учреждениях , что также отражается на их стоимости. Поэтому распространены в нашей стране и более старые методы диагностики.
В своём реферате я постараюсь осветить лишь некоторые из перечисленных, ввиду их наибольшего применения в клинической практике в нашей стране.
ИФА—иммуноферментный анализ, метод основанный на комбинации иммунного взаимодействия с ферментативной реакцией, направленной на оптически активный субстрат, с изменением оптической плотности пробы. Наибольшее распространение получил твердофазный метод, когда в качестве основы используется полистироловый планшет. Метод позволяет обнаруживать в исследуемой пробе ,как иммуноглобулины ,так и солюбилизированные антигены в концентрации до 1-2 нг/ мл. Средняя тест-система пределом чувствительности имеет около 10 нг/мл. Ниже будут приведены оба варианта проведения анализа. В России производством тест-систем ИФА занимаются следующие фирмы: НИАРМЕДИК (Москва), ДЖЕНЕЛАВИЯ-МИКСТ (Москва, совместно с институтом Пастера, Франция),НИИ микробиологии и вирусологии им. Пастера ( С.—Петербург) и другие.
Методика постановки относительна проста и не требует специального образования , в каждом наборе имеется инструкция по проведению и оценке результатов. Один набор расчитан обычно на проведение 88—92 проб , если планшет состоит из отдельных стрипов , то можно проводить анализ на стрипе из 8 лунок, т.е. 4—5 проб. В состав набора входит основной раствор для разведения сывороток и промывания, конъюгат, перекись водорода, индикатор—ФСБ, положительная и отрицательная контрольные сыворотки ( в зарубежных образцах ещё сыворотка среза), планшет с нанесённым диагностикумом, раствор стоп-реагента.
Схема проведения анализа следующая:
1. В каждую лунку планшета вносится исследуемая жидкость, при необходимости разведённая, за исключением лунок для контрольных сывороток и контроля конъюгата. В се помещается на инкубацию в термостат с температурой 37—42 градуса на время указанное в инструкции, последние западные тест системы имеют так называемые «цветные шаги» и не требуют инкубации в термостате, время её от 15 минут до 2 часов.
2. После инкубации лунки промываются с целью удаления не прореагировавших ингредиентов.
3. В осушенные лунки вносится конъюгат, представляющий собой моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека ( всех фракций или при селективном анализе какой-либо одной, чаще всего это фракция Ig G), меченные пероксидазой хрена. Планшет также помещается на инкубацию.
4. Проводится промывание планшета.
5. В лунки вносится свежеприготовленная смесь растворов перекиси водорода и индикатора, так называемый субстрат. Полученная смесь легко разлагается на свету и поэтому помещается в тёмное место на время , необходимое для ферментативного разрушения субстрата и изменения его окраски.
6. Реакция останавливается добавлением стоп-реагента ( его роль обычно играет 0,1 М раствор серной кислоты) .
7. Оценка полученных результатов проводится с помощью измерителя оптической плотности и проведения расчета для определения предела отрицательной экстинции пробы
В случае поиска антигена может добавляться ещё один шаг между 2 и3, дополнительно вносится высокоспецифический иммуноглобулин против конкретного антигена, если он будет помечен пероксидазой хрена, то отпадает потребность в конъюгате. Надо отметить ,что могут быть определены таким путём только солюбилизированные антигены.
В урологической практике подобные тест-системы могут применяться при диагностике таких заболеваний, как урогенитальный хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз, герпес половой, уреаплазмоз, некоторые аутоиммунные заболевания и ВИЧ—инфекция.
Недостатком метода является высокая чувствительность тест-систем к наличию в окружающей среде активных веществ, в частности ионов хлора, что требует особого режима работы с наборами , специального помещения с собственной системой вентиляции, методов его дезинфекции после работы и во время её.
РИФ—реакция иммунофлуоресценции, метод, основанный на осаждении на твёрдую фазу антигена или антител и последующей обработке флуоресцирующими антителами. Метод несколько уступает ИФА по специфичности и требует наличия люминисцентного микроскопа, а также определённого навыка работы со стороны персонала. Наибольшее распространение получила методика непрямой реакции иммунофлуоресценции.
В состав набора для постановки реакции входит: стекло с нанесённым на него антигеном или иммуноглобулиновым диагностикумом, рабочий раствор для разведения сывороток и промывания стёкол, антитела против иммуноглобулинов человека , меченые флуоресцирующим составом , бычий альбумин меченый родамином ( применяется для подавления неспецифических реакций и контрастирования),контрольные сыворотки. Такие тест-системы производятся в России НИИ микробиологии и вирусологии им. Пастера ( С.-Петербург), НИИ микробиологии им. Гамалеи (Москва), фирмой НИАРМЕДИК (Москва), и другими производителями.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
