w
длина
световой волны обусловлена принципом дополнительности цветов исследуемого
раствора и светофильтра. Например, для растворов, окрашенных в желтый цвет
используется синий светофильтр (440нм), для растворов синего цвета желтый
(590) иногда красный - 640 нм.
Способы расчета результатов фотометрии
w
условные
единицы
w
по
стандартным (эталонным) растворам
w
по
калибровочному графику
w с помощью
коэффициента пересчета
Способ расчета результатов фотометрии
по условным единицам
Это
фактически непосредственное выражение единиц оптической плотности исследуемого
раствора. Для удобства единицы оптической плотности умножают на коэффициент 100
или 1000 для выражения у.е. в больших целых числах. Например, сиаловые кислоты
130-200 у.е. соответствуют коэффициенту экстинции 0,13-0,20, умноженному на
1000 .
Способ расчета результатов фотометрии
по стандартным растворам
Эталонные
растворы обрабатываются параллельно с серией исследуемого биоматериала и
находятся в тех же условиях, что исследуемый материал.
Недостаток
- повышенный расход реактивов и рабочего времени.
Подготовка
эталонного раствора: из реактива хч, взвешивание на аналитических весах с
высокой точностью (для флуориметрии, а для ФЭК можно на торсионных),
растворение в мерной колбе, концентрация вещества в стандарте должна быть
близка к норме. Расчет исследований по стандартным растворам производится по
способу простой арифметической пропорции: стандарт умножить на пробу разделить
на стандарт.
Способ расчета результатов фотометрии
по калибровочному графику
Недостаток
- ограниченное количество методик со стабильными условиями проведения и с
хорошим подчинением результатов основному закону фотометрии. Калибровочные
графики строятся для каждого фотометра отдельно, перенос на другой аппарат
недопустим даже в случае использования однотипных фотометров, т.к. у каждого
аппарата свои технические особенности. Калибровочные графики проверяются не
реже 1 раза в год.
Правила построения калибровочного
графика
Проводят
исследование серии стандартных растворов, различающихся между собой
концентрацией. Диапазон концентраций должен охватывать как значения
физиологической нормы, так и наиболее вероятные пределы патологии для данного
исследуемого компонента. Для приготовления стандартных растворов навеска
берется только на аналитических весах, обязательно в параллелях (для снижения
вероятности ошибок, связанных с погрешностями взвешивания), растворение в
мерной колбе.
Калибровочный
график должен содержать:
Ø название метода исследования,
Ø заводской номер фотометра, к
которому построен график,
Ø указать длину световой волны,
толщину слоя кюветы,
Ø исходные данные для построения,
Ø дата построения
Способ расчета результатов фотометрии
по коэффициентам пересчета
Является
наиболее простым и быстрым. Формула: С=F x E, где С - концентрация исследуемого
компонента,
F
- коэффициент пересчета, Е - экстинция.
Коэффициент
пересчета является величиной специфической для каждого отдельного теста. Обычно
указывается в описании метода исследования. Можно рассчитывать самому на
основании исследования стандартных растворов. За основу можно взять ранее
построенный калибровочный график. Коэффициенты требуют проверки не реже 1 раза
в год.
Коэффициенты
используются в анализаторах. Они вводятся в память компьютера и выдаются
автоматически.
Методы оценки результатов фотометрии
w
по
конечной точке (измерение в конечной точке) - учет образования продукта за
некоторое время инкубации. Расчет результатов по стандарту.
w
по
фиксированному времени - требуется применение фотометров с термостатируемыми
кюветами. Устанавливается количество нарабатываемого (расходуемого) продукта
за определенный промежуток времени, расчет концентрации по стандарту.
w
кинетически
(кинетическое измерение) - производят измерение оптической плотности через
определенные интервалы времени. Используется для ферментативных методов
Особенности эксплуатации
фотометрической аппаратуры
Показания
фотометров можно снимать в единицах оптической плотности или в процентах
поглощенного или прошедшего света относительно фоновых величин (шкалы разных
цветов). Во всех, предназначенных для измерений оптической плотности приборах,
наибольшая точность достигается при значениях экстинции около 0,3, т.е. когда
проходит примерно половина падающего света. По мере удаления в ту или другую
сторону точность измерения уменьшается!
Экстинция
раствора есть произведение его концентрации на толщину слоя раствора.
Оптимальны в смысле чувствительности, точности и удобства кюветы с длине
оптического пути 1 см.
Точность
фотометрии значительно возрастает при использовании проточных кювет.
Основные источники ошибок
при фотометрии
1).Работа
с растворами, имеющими слишком высокую
(более 1) или слишком низкую (менее 0,3) оптическую плотность резко
увеличивает погрешность измерения.
2).
Для фотометрии пригодны лишь прозрачные растворы. Мутные растворы рассеивают
свет и снижают достоверность измерений. Мутные окрашенные растворы
использоваться не должны.
Рефрактометрия
Метод
основан на измерении показателя преломления света при прохождении его через
оптически неоднородные среды.
Пример
– определение общего белка в сыворотке. В лаборатории используется мало.
Обыкновенное и плоскополяризованное
электромагнитное поле излучения
Поляриметрия
Основан на способности веществ в растворе
изменять плоскость поляризованного луча света.
Пример – лазерный поляриметр для
определения глюкозы в моче. В КЛД применяется мало.
