Суть этой реакции заключается в следующем:
1. На стекло с нанесённым на него диагностикумом наносится около 8—10 мкл исследуемой жидкости (обычно сыворотки), так чтобы капли не смешивались. Стекло помещается в термостат на инкубацию в условиях водяной камеры при температуре 37 градусов, важно чтобы не произошло высыхания капель.
2. После инкубации стекло промывают путем встряхивания на лабораторном шунтеле в течении 10—15 минут и затем сушат до исчезновения влаги.
3. Затем наносят смесь состоящую из раствора бычьего альбумина , меченого родамином и флуоресцирующих антител против иммуноглобулинов человека в рабочем разведении по 5 мкл каждого. Стекло помещают на инкубацию в тех же условиях.
4. Промывают и сушат.
5. С помощью люминесцентного микроскопа проводят оценку результатов ,ответ выдаётся в крестах или положительным титром исследуемой сыворотки. Критерии оценки: ++++ - яркое изумрудного цвета свечение при отсутствии неспецифики, +++ и ++ в зависимости от интенсивности свечения ,-- -отсутствие специфического свечения .
Данный тип тест-систем может применятся в основном при диагностике заболеваний , перечисленных выше. Себестоимость данного метода меньше, чем ИФА, но время необходимое для проведения большого количества анализов намного больше, так как на одном стекле размещается порядка 8—14 полей для нанесения проб. Достаточно неприхотливый метод к условиям окружающей среды, но требующий осторожности при хранении.
Следующий метод – метод встречного иммуноэлектрофореза. Смысл метода состоит во взаимодействии антигена со специфическими антителами в полиакриламидном геле с образованием видимого невооружённым глазом или с помощью микроскопа преципитата серповидной формы на линии соединяющей лунки с содержащимися в них реагентами. Перемещению молекул способствует создаваемое электрическое поле.
Для проведения анализа необходимо наличие электрофоретической камеры, веронал- мединалового буфера с pH=8,6 , специальной пластины с нанесённым на неё гелем с лунками диаметром 3 мм, растворов реагентов, раствора для разведения сыворотки. Удобством метода является возможность проведения анализа по нескольким направлениям, то есть в один ряд лунок может быть помещён антиген А, во второй ряд вносятся исследуемые сыворотки в необходимом разведении и в третий ряд помещён антиген В и так далее. Под влиянием постоянного электрического поля иммуноглобулины сыворотки и антиген, обладающие разными электрическими зарядами , двигаются по смоченной буферным раствором поверхности геля со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц. После образования преципитата пластинка с гелем может быть окрашена для удобства интерпретации результатов, возможно фотографирование пластинки для последующего сравнительного анализа полученных результатов, при исследовании парных сывороток. Метод не получил достаточно широкого применения из-за трудоемкости процесса и высокой неустойчивости к посторонним воздействиям.
Одним из наиболее информативных методов исследования является полимеразная цепная реакция—ПЦР. Метод получил путёвку в жизнь благодаря открытию процессов происходящих при делении клеток с молекулой ДНК. Метод основан на получении фрагментов ДНК в неограниченном количестве из одного подобного фрагмента с использованием методики последовательного воздействия на имеющиеся молекулы ДНК ферментов клеточного ядра , таких как, ДНК—расплетаза, различных рестриктаз запрограммированных на рассечение молекулы ДНК в строго определённом локусе – сайте , ДНК—полимеразы и других. Выделение искомой ДНК проводится с разрушением всех клеточных структур в исследуемом образце и последующего смешивания с ацетатом калия и центрифугирования при комнатной температуре в течении 20 минут, получившийся супернатант смешивают с изопропанолом, помещают в баню из сухого льда с этанолом на 5 минут и затем вновь центрифугируют. Осадок промывают 70 % этанолом и высушивают под вакуумом, добавляют буфер Трис-ЭДТА и ресуспендируют, затем добавляют раствор РНКазы. Для рестрикции ДНК обрабатывают раствором фенола и осаждают ДНК холодным 70% этанолом. После центрифугирования на гравитационной центрифуге в градиенте CsCl с этидиумбромидом осадок ресуспендируют в 100 мкл ТЕ—буфера , после этого можно загружать образец для последующего умножения. После умножения ДНК может быть определена одним из вышеперечисленных методов, но чаще используется методика установления нуклеотидной последовательности и последующего сравнения и анализирования с известными уже генетическими картами микроорганизмов с использованием компьютерной технологии многофакторного анализа.
Данный метод хоть и является очень информативным, но его использование в клинической практике сильно ограничено стоимостью исследования и необходимостью иметь специальное оборудование, тоже очень дорогостоящее и обученный персонал. За рубежом эти проблемы решаются и там этот метод уже внедрён, и получены неплохие результаты в диагностике различных заболеваний.
Все вышеперечисленные методы диагностики давно эффективно используются в клинике и пока не потеряли своей актуальности , не произойдет этого и в ближайшее время, если не произойдет очередного прорыва в данной отрасли медицины.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1.Петров Р.В. Иммунология.—М.,1987
2.ВИЧ—инфекция/ под ред. Нечаева Э.А.—СПб.,1994.
3.Бациллы. Генетика и биотехнология./под ред. Харвуда К.—М.,Мир,1992.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.