Лабораторные животные и экспериментальная инфекция, страница 12

Способность поверхности эритроцитов к адсорбции крупномолекулярных антигенов (белковых) повышается после обработки их танином. Для обработки эритроцитов раствор танина в изотоническом растворе хлорида натрия (1:20000) всегда готовят непосредственно перед постановкой реакции; танин должен обладать хорошей растворимостью. Хранить танин следует в темной посуде и прохладном сухом месте. Из осадка трижды отмытых изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитов готовят 2,5 % взвесь в фосфатно-буферном растворе рН 7,2. Равные объемы взвеси эритроцитов и раствора танина в изотоническом растворе хлорида натрия (1:20000) смешивают и оставляют на 15 мин при 37°С (термостат или водяная баня) или на 30 мин при комнатной температуре, затем смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов промывают тем же фосфатно-буферным раствором. Осадок эритроцитов доводят изотоническим раствором хлорида натрия до исходной 2,5 % взвеси.

Реакцию непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) с тонизированными эритроцитами проводят в двух вариантах: с известным антигеном для обнаружения антител (по Бойдену) с известными антителами (сывороткой) для выявления антигена (по Рыцаю). Антигенами в реакции непрямой агглютинации могут служить очищенные антигены соответствующих микробов, экстракты бактериальных взвесей, надосадочной жидкости формалиновых, спиртовых, гретых бактериальных вакцин.

Реакция непрямой гемагглютинации для обнаружения антител. До титрования испытуемой сыворотки должна быть определена рабочая доза антигена, способная при адсорбции на эритроцитах обеспечить максимальный титр соответствующей иммунной сыворотки. Антиген разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,2) и соединяют (сенсибилизируют) эритроциты (разведенные тем же буферным раствором до 1-2,5-5-10 % взвеси) с антигеном в различных разведениях. Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при 37°С. Затем эритроциты отмывают 2-3 раза изотоническим раствором хлорида натрия центрифугированием 1-1 ½ мин при 1000-1500 об/мин. Из каждой порции отмытых эритроцитов, сенсибилизированных разными разведениями антигена, готовят в изотоническом растворе хлорида натрия 0,5-1 % взвеси, которые в количестве 0,25 мг добавляют к иммунной сыворотке, разведенной изотоническим раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:2800 и разлитой по 0,25-0,5 мг в луночки пластины из органического стекла. Результаты учитывают по четырех плюсовой системе через 2 ч содержания в термостате. Оценка результата зависит от характера осадка эритроцитов. При резко положительной реакции (4 плюса) эритроциты равномерно покрывают всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями; при реакции 3 плюса на фоне склеившихся эритроцитов (в виде пленки) имеется в центре небольшое кольцо из осевших несклеившихся эритроцитов; несколько меньшую степень агглютинации с большим количеством несклеившихся эритроцитов оценивают как положительную реакцию 2 плюса; при отрицательной реакции, как и в контроле, скопление эритроцитов имеет вид маленького диска (пуговки). Рабочей дозой антигена считают дозу, с которой иммунная сыворотка реагирует в реакции гемагглютинации 2 плюса в самом большом разведении при полном отсутствии гемагглютинации в контролях.

Реакция торможения гемагглютинации. При постановке ориентировочной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) на стекле на чистые обеззараженные предметные стекла или чашки Петри наносят на некотором расстоянии друг от друга по одной капле типоспецифических иммунных и нормальной сывороток. Затем к ним добавляют по одной капле испытуемого материала и 5 % взвеси эритроцитов. Жидкости тщательно перемешивают отдельными пастеровскими пипетками и макроскопически учитывают результаты после появления хлопьевидного осадка в смеси, содержащей нормальную сыворотку. Иммунная сыворотка, специфическая для выделенного вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность, и эритроциты не агглютинируются. Однако ориентировочная реакция может быть отрицательной не только при типовом несоответствии вируса и сывороток, но и в случае высокой концентрации вируса в капле. Поэтому при отрицательной ориентировочной реакции рекомендуется проводить титрование вируса в развернутом ряду.