Методы изучения наследственности человека. Половой хроматин, методы определения полового хроматина: Методическая разработка, страница 2

            ОБОРУДОВАНИЕ: микроскопы, стекла предметные, стекла покровные 18х18 мм, шпатель металлический, стакан химический, пипетка глазная, кювета эмалированная, бумага фильтровальная, иммерсионное масло, красящий раствор ацето-орсеина, спирт-ректификат в литровых банках, пинцет анатомический.

            ХОД РАБОТЫ: прополоскать рот водой для удаления микрофлоры. Скоблящими движениями шпателя с некоторым нажимом провести по слизистой оболочке щеки. Полученную на кончике шпателя беловатую массу нанести круговыми движениями на обезжиренное предметное стекло, распределяя мазок тонким слоем. Следует стандартизировать процедуру взятия мазка, соскабливая слизистую определенное число раз с определенным нажимом, поскольку в многослойном эпителии слизистой оболочки щеки количество ядер с половым хроматином различно в разных слоях. Подсушить мазок на воздухе. На готовый мазок нанести 1-2 капли ацето-орсеина и покрыть покровным стеклом. Избыток краски вокруг покровного стекла удалить полосками фильтровальной бумаги. Продолжительность окраски длится в среднем 10 минут. Ход окраски контролируется под микроскопом. Мазок просмотреть под микроскопом сразу же после окраски во избежание высыхания препарата. Препарат исследовать обзорно под малым увеличением микроскопа. Найти скопления клеток и детально рассмотреть их на иммерсии (объектив 90х. окуляр 15х). Для исследования пригодны ядра правильной формы с тонкой сетью хроматина, с неповрежденной и четкой ядерной оболочкой. Непригодны для учета ядра с подогнутой или фестончатой ядерной оболочкой или находящиеся в разных степенях пикноза. В качестве Х-хроматина учитывается самый большой хромоцентр, прилегающий к ядерной мембране, имеющей форму треугольника, полулуния или круглого образования. Подсчитывают 100 ядер и отмечают число ядер с одним или более тельцем полового хроматина.

            Нормальное содержание Х-хроматина в ядрах клеток у лиц женского пола составляет от 10 до 50 на 100 ядер, т.е. 10-50%. Нормальное содержание Х-хроматина в ядрах клеток у лиц мужского пола составляет от 2-4 на 100 ядер, т.е. 0-2-4%. В случаях с числом телец Х-хроматина у женщин ниже 15, а у мужчин выше 4-5% необходимо увеличить число просмотренных ядер до 300-400 и проводить повторное исследование. Следует помнить, что уменьшение или увеличение глыбки полового хроматина может свидетельствовать о возможной структурной аномалии Х-хромосомы.

2.2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА

ГЕМАТОКСИЛИН-ЭОЗИНОВЫМ МЕТОДОМ

            ОБОРУДОВАНИЕ: микроскопы, стекла предметные, стекла покровные 18 х 18 мм, шпатель металлический, стакан химический, пипетка глазная, кювета эмалированная, бумага фильтровальная, иммерсионное масло; красящий раствор гематоксилин и эозин, смесь Никифорова, пинцет анатомический.

            ХОД РАБОТЫ: снимите поверхностный слой эпителия слизистой оболочки ротовой полости стерильной салфеткой. Затем сделайте легкий соскоб слизистой оболочки ротовой полости шпателем, после чего из полученного материала приготовьте мазок на предметном стекле, предварительно тщательно обезжиренном. Для фиксации препарата опустите его на 5-10 мин в стеклянный стаканчик со смесью спирта с эфиром. По окончании фиксации покрасьте препарат гематоксилином и эозином, накройте покровным стеклом и рассмотрите под микроскопом с иммерсионным объективом.

            В поле зрения увидите эпителиальные клетки слизистой оболочки ротовой полости с хорошо прокрашенными ядрами. В последних можно заметить половой хроматин в форме небольшого плоско-выпуклого образования, прилегающего к ядерной оболочке. От других хроматиновых глыбок он отличается размером (крупнее), плотностью и характерным расположением. Обратите внимание, что на препаратах из ротовой полости мужчин половой хроматин встречается очень редко, в то время как на препаратах из ротовой полости женщин он обнаруживается в 40-60% клеточных ядер.

2.3. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ У-ХРОМАТИНА

            Материал для исследования и техника приготовления препаратов клеток такие же, как для исследования Х-хроматина.

            ОБОРУДОВАНИЕ: микроскоп, метанол, основной раствор, 0, 5% р-р акрихина, рабочий красящий раствор акрихина (2-3 капли основного раствора на 150 мл дистиллированной воды).

            ХОД РАБОТЫ: После фиксации препарата метанолом переместить его в рабочий раствор акрихина на 5 мин. Покрыть покровным стеклом, удалить фильтровальной бумагой избыток красителя и приступить к микроскопированию в ультрафиолетовом свете на микроскопе МБИ-15.

            В качестве У-хроматина учитывают наиболее интенсивно светящийся и самый большой хромоцентр, который может быть расположен в любой точке ядра, но чаще вблизи ядрышка (ядрышко при флуоресцентном методе выглядит оптически пустым). В норме клетки у лиц мужского пола характеризуются наличием 20-90% ядер с У-хроматином.

            Определение полового хроматина является ориентировочным и обязательно должно быть дополнено исследованием хромосомных наборов. На основании исследования полового хроматина нельзя делать выводы о точном состоянии системы половых хромосом.

III. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

 1. Сколько телец Барра можно обнаружить у пациентки с синдромом

            Шерешевского-Тернера? 2. Сколько глыбок Х-хроматина можно обнаружить в клетках мазка буккального эпителия у женщины с диагнозом трисомия Х? 3. Какое максимальное число телец Барра можно обнаружить в интерфазных ядрах клеток больного с полисомией Y? 4. Сколько телец Барра можно обнаружить в клетках у интерсекса с кариотипом 45, ХО/46, ХY? 5. В мазке буккального эпителия встречаются одновременно ядра с одной и двумя глыбками Y-хроматина, а также ядра  флуоресцирующих глыбок. Какой из этих трех типов ядер наиболее значим для диагностики синдрома дисомии Y? 6. Какие типы ядер (по содержанию Y-хроматина) можно найти в мазке клеток буккального эпителия у мозаика 46, XY/47, XYY? 7. Описана пара монозиготных близнецов, которая состояла из нормального мужчины и женщины с синдромом Шерешевского-Тернера.

            Попытайтесь объяснить появление таких близнецов.

IY. ТЕСТЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

 1. В мазке клеток слизистой оболочки рта у пациентки фенотипически женского пола не обнаружен половой хроматин. Каковы возможные кариотипы этой больной?

а) 46, ХХ;

б) 45, ХО/46, ХХ;

в) 46, XY;

г) 45, ХО/466, XY;

д) 45, ХО.

Как установить окончательный диагноз?

2. Какие типы ядер (по содержанию Х-хроматина) можно выявить у мозаиков 46, ХХ/47, ХХХ?

а) 0;

б) 1;

в) 2;

г) 3.

3. Если у человека фенотипически мужского пола в интерфазных ядрах обнаруживается Х-хроматин, то его кариотип может быть:

а) 46, XY;

б) 46, ХХ;

в) 46, ХХ/46, XY;

г) 47, XXY;

д) 46, ХХ/47, ХХY.

4. В мазке буккального эпителия встречаются в равном количестве ядра, содержащие одну или две глыбки Х-хроматина. В некоторых ядрах тельца Барра не обнаруживаются.

Можно предположить, что кариотип пациента:

а) 46, ХХ; 

б) 47, ХХY;

в) 47, ХХХ;

г) 46, ХХ/47, ХХХ;

д) 46, ХХ/47, ХХY.

5. В большинстве интерфазных ядер буккального эпителия пациента обнаружен Х-хроматин. Больному с каким из перечисленных карио типов скорее всего принадлежит этот анализ?

а) 45, ХО?46, ХY;

б) 45, ХО/46, ХХ;

в) 46, ХХ/46, ХY;

г) 46, ХY/47, ХХY;

д) 46, ХХ/47, ХХХ.

6. Дисомия Y возникает при:

а) нерасхождении хромосом в первом делении зиготы;

б) нерасхождение хромосом в первом делении мейоза;

в) нерасхождение хромосом во втором делении мейоза;

г) наличии у отца пациента сбалансированной транслокации типа D/Y;

д) наличии у отца пациента сбалансированной транслокации типа G/Y.

ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ:

1. в, г, д.

2. а, б, в.

3. любой, кроме а.

4. в, г.

5. д.

6. а, г, д.