Антигены системы HLA: структура и функции, страница 5

8 – 100-81% гибель клеток

6 – 80-41% гибель клеток

4 – 40-31% гибель клеток

2 – 30-21% гибель клеток

          Определение HLA-DR-фенотипа проводится в пролонгированном лимфоцитотоксическом тесте (модификация Van Rood,1977; Singal, 1977).

          1 этап – до добавления комплемента – время экспозиции 1 час при 37°С.

          2 этап с 5 мкл комплемента – 2 часа при 20-25°С.

          Для определения HLA-DR антигенов используются лимфовзвеси, обогащенные В-лимфоцитами. Для этого клетки, выделенные из крови на верографин-фиколе, необходимо разделить на Т- и В-субпопуляции с помощью нейлоновой ваты, 200мг которой помещается в пластиковый шприц объемом 1-2мл. Вата смачивается смесью питательной среды с инактивированной сывороткой человека АВ (IV) – 5% смесь. Взвесь лимфоцитов помещают в колонку с нейлоновой ватой и инкубируют 40 мин. в горизонтальном положении при температуре 37°С. Дважды капельно промывают колонку теплым раствором Хенкса (37°С) Полученные в результате смыва с нейлона клетки – Т-лимфоциты. Трижды используя небольшие количества раствора Хенкса (общий объем 5-7мл), форсированно отжимают с помощью поршня шприц с нейлоновой ватой. Полученные в результате отжимания клетки – В-лимфоциты, используют для постановки микролимфоцитотоксического теста.

          Полученные результаты реакции заносятся в таблицу, соответствующую строению лунок микропланшета, и выводят результат типирования с учетом специфичности прореагировавших антисывороток, интенсивности реакции цитотоксичности, моно- или полиспецифичности прореагировавших антисывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов. Эти группы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Перекрестно реагирующие группы HLA-антигенов

HLA-A A1, A36 A1, A3, A11 A2, A28 A2, A9, A28 A10, A11 A10, A28, A33 A29, A30, A31, A33 A30, A31 HLA-B B5, B15, B17, B18, B21, B35, B53, B70 B7, B22, B27, B40, B42, B48 B8, B14, B18, B39 B12, B13, B21, B47 B13, B21, B40, B41, B45, B47, B48 B15, B17, B21, B35, B70 B27, B13, B47

HLA-A/B A2, B17 A9, A25, A32, BW4 HLA-B/C B46/CW3 HLA-C CW4, CW6 CW5, CW8 HLA-DR DR1, DR10 DR3, DR5, DR6 DR4, DR7, DR9 DR5, DR8

          Недостатками серологического типирования являются наличие перекрестных реакций, слабая аффинность антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.

          В настоящее время номенклатура серологически выявляемых антигенов включает в себя 28 специфичностей локуса HLA-А, 61 специфичность локуса HLA-B, 10 специфичностей локуса HLA-C, 23 специфичности локуса HLA-DR, 9 специфичностей локуса HLA-DQ и 6 специфичностей локуса HLA-DP (табл.2).

Таблица 2

HLA-антигены, выявляемые серологическими методами

(HLA Report, 1996)

А	В		С	DR	DQ	DP
A1 A2 A203 A210 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9) A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A34(10) A36 A43 A66 A68(28) A69 A74(19) A80	B5 B7 B703 B8 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B27 B2708 B35 B37 B38(16) B39(16) B3901 B3902 B40 B4005 B41 B42 B44(12) B45(12) B46 B47	B48 B49(21) B50(21) B51(5) B5102 B5103 B52(5) B53 B54(22) B55(22) B56(22) B57(17) D58(17) B59 B60(40) B61(40) B62(15) B63(15) B64(14) B67 B70 B71(70) B72(70) B73 B75(15) B76(15) B77(15) B78 B81 Bw4 Bw6	Cw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9(w3) Cw10(w3)	DR1 DR103 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 DR9 DR10 DR11(5) DR12(5) DR13(6) DR14(6) DR1403 DR1404 DR15(2) DR16(2) DR17(3) DR18(3) DR51 DR52 DR53	DQ1 DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(1) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(30	DPw1 DPw2 DPw3 DPw4 DPw5 DPw6

          В 90-х годах на смену серологическим методам типирования пришли так называемые процедуры ДНК-типирования, основанные на различных вариантах полимеразной цепной реакции и молекулярной гибридизации. Эти методы заключаются в накоплении необходимого для анализа значительного количества ДНК путем ее полимеризации и в использовании зондов, комплементарных анализируемым участкам ДНК. Переход на новые технологии позволил вместо 23 серологически типируемых HLA-антигенов локуса DR, установить наличие около 70 аллельных вариантов; аналогичная ситуация сложилась и при анализе других локусов.

          Практика показывает, что для типирования аллелей HLA-DR наиболее приемлемыми являются молекулярно-генетические методы. Это обусловлено трудностями получения специфических антисывороток. Кроме того, одним из преимуществ методов молекулярной генетики является то, что для типирования не требуется наличие жизнеспособных клеток, материал для исследования, то есть ДНК, может храниться в течение многих лет, что дает возможность повторных исследований с включением дополнительных генетических маркеров. Для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.

          Разработано несколько вариантов генотипирования HLA. Среди них:

§  PCR-SSOP-гибридизация амплифицированных фрагментов ДНК, фиксированных на мембранах, с олигонуклеотидными зондами;

§  SSP-амплификация праймерами, имеющими аллельную специфичность;

§  PCR-RFLP-рестриктивный анализ продуктов амплификации;

§  RH-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами, фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластике).