Количественное определение иммуноглобулинов А, М, G в биологических жидкостях реакцию по Манчини

Количественное определение иммуноглобулинов А, М, G в биологических жидкостях реакцию по Манчини.

(антисыворотку к Ig G,например, или к IgA, или к IgM) в определенном количестве (в титре) вно-сят в агаровый или агарозный гель. После застывания в агаровом геле с помощью специального пробойника делают лунки диаметром 1,5–2 мм, в которые вносят исследуемый материал.Приналичии в исследуемом образце иммуноглобулинов соответствующегокласса происходит реакция взаимодействия антиген (иммунолобулин определяемого класса исследуемого образца) – антитело (диагностическая антисыворотка, или анти Ig определенного класса).

возникает укрупнения комплексов за счет объединения нескольких в единый комплекс, т. е. об-разование преципитатов.

Для количественного определения концен-трации иммуноглобулинов какого-либо класса необходимо иметь стан-дартный образец, содержащий известную концентрацию Ig разныхклассов.

На окрашенных пластинах проводят измерение диаметра полученных колец преципитации для разведений стандартной сыворотки и исследуемых препаратов биологических жидко-стей. По результатам измерения колец преципитации стандартной сыво-ротки строят калибровочные кривые для каждого иммуноглобулина, где по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации в мм, а по оси ординат – известную концентрацию данного иммуноглобулина в мг/мл, содержащуюся в данном разведении сыворотки. Концентрацию иммуно-глобулинов в исследуемых препаратах определяют с использованием по-лученных калибровочных кривых.

Лабораторные методы специфической аллергодиагностики

К методам, выявляющим аллергические реакции немедлен-

ного, В-зависимого типа, относятся:

a) определение общего IgE (однако его высокий уровень может быть и в продуктивной фазе иммунного ответа);

b) определение аллерген-специфических Ig E и IgG4-.

Соответствующий аллерген (или антитела к IgE) фиксирован на по-верхности иммунологического планшета или бумажного диска. При инку-бации пробы специфические антитела связываются с твердой фазой.

Промывка моющим раствором удаляет с поверхности планшета или диска все несвязавшиеся антитела. Инкубация диска планшета) с антисыво-роткой против IgE человека (или против IgG4), конъюгированной с фер-ментной меткой (чаще – пероксидаза хрена), и последующая ин-кубация с хромогенным субстратом приводит к интенсивному окраши-ванию пробы при наличии общего или аллерген-специфических IgE(IgG4). Регистрация результатов

1. Регистрация оптической плотности (ОП): измерить ОП содержимого лунок на фотометре при длине волны 492нм.

2. Построение калибровочной кривой: по значениям ОП и известным концентрациям калибраторов (см. табл. 2) построить кривую.

3.По значениям ОП для исследуемых сывороток с помощью калибровочной кривой определить содержание в них IgE в КЕ/л.

Определение ревматоидного фактора (РФ).

Ревматоидный фактор – это аутоантитела к Fc-фрагменту IgG.Любые частицы, покрытые IgG, могут быть агглютинированыревматоидным фактором. Первоначально для обнаружения ревматоидногофактора использовались покрытые антителами эритроциты барана или че-ловеческие эритроциты группы 0 (Реакция Валера-Роза). В последующемих заменили на частицы латекса и бентонита, что повысило чувствительность метода.

Реакция Ваалера-Роза. Используются эритроциты барана, нагру-женные антителами кроличьей сыворотки. В присутствии РФ происходитсклеивание (агглютинация эритроцитов) в результате взаимодействия егос гаммаглобулином, находящимся на поверхности эритроцитов барана.

Реакция считается положительной при титре Ат, превышающем 1:16.

Регистрация результатов. В контрольной пробе и при отрицательной реакции – равномерное помутнение.

При положительной реакции в пробе с испытуемой сывороткой эритроциты склеиваются, в капле появляется зернистость.

Латекс-тест. Исследование латекс-теста позволяет сделать по-луколичественное определение РФ в неразбавленной сыворотке методомагглютинации латексных частиц. Метод удобен в использовании, эконо-мически выгоден, время анализа – 2–3 мин. В наборе имеются положи-тельный и отрицательный контроли.

Принцип метода. Основан на реакции агглютинации между РФ

образца пациента или контрольной сывороткой и человеческим IgG, нахо-дящимся на полистироловых латексных частицах.

IgG, осажденный на латексных частицах + АТ к IgG, находящиесяв исследуемой сыворотке или положительном контроле, агглютинациялатекс-частиц, видная невооруженным глазом

Регистрация результатов

анализ образцов пациентов проводить после получения результатов отрицательного и положительного контролей;

отсутствие агглютинации в сыворотке указывает на отсутствие РФ;

отрицательным будет результат, содержащий в образце РФ менее 20

МЕ/мл;

положительный результат (четкая агглютинация) указывает на коли-чественное содержание РФ в сыворотке пациента. При положитель-ной реакции (четкая агглютинация) тест необходимо повторить, удва-ивая разведение сыворотки (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 и т. д.). Наи-большее разведение, при котором происходит агглютинация, считает-ся титром реакции. В сыворотке диагностическим титром в реакции латекс – агглютинации считается 1:20.