Наиболее широко используемым методом оценки функциональной активности системы комплемента является метод 50% гемолиза. Его суть сводится к тому, что исследуемый образец сыворотки крови в разных разведениях смешивают с гемолитической системой, играющей индикаторную роль. При этом, гемолитические системы, используемые для тестирования классического и альтернативного путей активации комплемента, различаются.
Гемолитическая система для тестирования классического пути активации комплемента представляет собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных (обработанных) антителами к ним же. Иными словами, гемолитическая система - это суспензия комплексов антиген (эритроцит барана) - антитело (антитела к эритроцитам барана) в желатин-вероналовом буфере с ионами кальция.
В случае определения активности альтернативного пути используют гемолитическую систему, представленную суспензией эритроцитов кролика в фосфатном солевом буферном растворе. Цитопазматическая мембрана кроличьих эритроцитов содержит полисахариды значимые активаторы альтернативного пути, что и определяет возможность ее использования для тестирования активности альтернативного пути активации системы комплемента.
Для приготовления гемсистемы использую суспензию эритроцитов барана/кролика, отмытую от лизированных эритроцитов. Для отмывания эритроцитов в пробирку вносят 0,2 - 0,3 мл суспензии эритроцитов, к которым добавляют 10 мл изотонического раствора хлорида натрия (физиологического раствора), суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют 10 минут при 1500 об./мин. Супернатант (надосадочная жидкость) бывает окрашен в красно-оранжевый цвет за счет выделившегося из разрушенных эритроцитов гемоглобина. Супернатант тщательно удаляют из пробирки с помощью пипетки. Затем процедуру отмывания повторяют тем же образом, добиваясь совершенно прозрачного супернатанта. В конце из плотного осадка эритроцитов готовят 3% (по объему) взвесь в изотоническом растворе. Например для приготовления 10 мл 3% суспензии эритроцитов надо взять 0,3 мл эритроцитов (плотного осадка) и 9,7 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Гемолитическая система для тестирования классического пути активации системы комплемента - это смесь равных объемов 3% взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки, взятой по троекратному титре (т.е. в количестве достаточном для опсонизации эритроцитов, но недостаточном для полного связывания всех эритроцитов, т.е. для их агглютинации).
Гемолитическая сыворотка представляет собой антитела к эритроцитам барана, представленные IgG, выпускаемые специализированными предприятиями. Для ее получения проводят иммунизацию лабораторных животных, например лошадей, кроликов, коз. Иммунизация, т.е. искусственное введение в организм антигена (в данном случае – эритроцитов барана) приводит к развитию гуморального иммунного ответа с продукцией антигенспецифических антител. Гемолитическая сыворотка используется для постановки широкого спектра иммунологических реакций, включая определение активности комплемента.
Смешивание гемолитической сыворотки с эритроцитами производят по возможности быстро, причем гемолитическую сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов, а не наоборот. Смесь выдерживают при 370С в термостате 30 мин для сенсибилизации эритроцитов.
Гемолитическая система для тестирования активности альтернативного пути – это 3 % -суспензия эритроцитов кролика в изотоническом фосфатном буфере.
Все пробирки инкубируют при + 37 °С в течение 30 минут, что необходимо для активации классического пути системы комплемента. Затем для остановки реакции все пробирки ставят в холодильник на 10мин. Затем все пробирки центрифугируют при
2000 об./мин. 10 минут.
Регистрацию результатов проводят либо визуально, сравнивая цвет супернатанта опытных пробирок со стандартом (контрольное разведение), но лучше - с помощью спектрофотометра (измерение проводят на длине волны поглощения гемоглобина, 412 – 432 нм). Определяют гемолитическую активность системы комплемента, выражая ее в условных единицах СН50.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.