Для сравнительной оценки воздействия радиации на физико-химическое состояние биологических мембран получают тимоциты от контрольных (интактных) и облученных животных.
Все операции по выделению тимоцитов проводят на холоду (при t =4°С).
1. Крыс декапитируют. Вскрывают брюшную полость, с обеих сторон рассекают диафрагму и ребра, целиком удаляют грудину. За грудиной находится тимус - беловатый, плоский, состоящий из двух долей орган. Аккуратно отрезают от тимуса паратимические лимфатические узлы, расположенные в прилежащей к тимусу соединительной ткани. Препарируя тимус, эти узлы надо оставить на месте, т.к. они плохо различимы на поверхности выделенного органа. Если случайно с тимусом будут выделены и паратимические узлы, то полученная взвесь тимоцитов будет содержать периферические В и Т-лимфоциты. Удаленный тимус обмывают средой PBS (pH 7,4) в чашке Петри, стоящей на льду.
2. Полученный тимус измельчают механически ножницами на нейлоновой ткани до кашицеобразного состояния и фильтруют через нейлоновое сито. К клеточной массе добавляют 3 мл среды PBS (pH 7,4) и переносят в центрифужную пробирку объемом 10 мл. Пипеткой аккуратно ресуспензируют клеточную взвесь и удаляют оставшиеся конгломераты и остатки соединительной ткани. Объем с выделенными клетками доводят до 5 мл средой PBS.
3. С помощью пастеровской пипетки аккуратно, избегая перемешивания, наслаивают полученную суспензию на градиент фиколл-верографин (р=1,087). Центрифугируют при 400g (1500 об/мин) в течение 30 минут при температуре 20°С. При этом образуется тонкий слой полиморфно-ядерных лейкоцитов. Отсасывают прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононуклеаров с помощью пастеровской пипетки. Затем собирают образовавшийся слой клеток и ресуспендируют в 5 мл PBS.
3. Выделенные на градиенте плотности клетки отмывают центрифугированием в течение 7-10 минут при 1500 оборотов в минуту (400g). После этого тимоциты оседают на дно пробирки. Надосадочную жидкость удаляют аккуратно пипеткой, а осадок ресуспендируют в 5 мл среды PBS (pH 7,4). Отмывку производят три раза. После последнего промывания отсасывают супернатант и объем взвеси клеток доводят PBS (pH 7,4) до 1 мл. Полученная суспензия клеток может быть использована для определения их концентрации и дальнейшего исследования.
Задание 2. Подсчет клеток в гемоцитометре
Материалы и оборудование: микроскоп, пастеровская пипетка, камера Горяева.
Ход работы:
Для последующего исследования влияния радиации на мембранные структуры тимоцитов необходимо с помощью гемоцитометра (камера Горяева) провести подсчет клеток контрольных и облученных животных.
1. Камеру Горяева промывают дистиллированной водой и высушивают. Увлажняют два параллельных края покровного стекла и тут же плотно притирают к краям камеры до появления радужных колец Ньютона. Благодаря силам сцепления покровное стекло должно остаться неподвижным даже при переворачивании камеры.
2. Каплю взвеси вносят в одну из двух половин камеры так, чтобы пространство между дном камеры и покровным стеклом было полностью заполнено. Оптимальная концентрация для подсчета клеток в гемоцитометре составляет - 107 клеток/мл. В случае необходимости перед подсчетом клеточную взвесь разбавить PBS.
3. Камеру примерно на минуту оставляют на горизонтальной поверхности для оседания клеток.
4. Под микроскопом с объективом 10 и 40 кратного увеличения подсчитывают не менее 200 клеток, расположенных внутри больших квадратов; клетки, расположенные на границах квадрата считают через одну.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.