Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 4

m_A + m_B = m₀ = const                                (10)

Частицы А и В могут быть независимыми, и тогда речь идёт об анализе специальных смесей, либо эти частицы могут взаимно превращаться друг в друга, например, в результате реакции таутометрии, поворотной изомерии, ионизации и т.д. Анализ таких смесей представляет одну из наиболее важных задач спектрофотометрии.

Спектрофотометрический метод может быть применен для анализа смеси только в том случае, если спектры компонентов заметно отличаются. Предположим, что спектры чистых веществ А и В имеют вид, показанный на рис. 3.

               Рис. 3                                                  Рис. 4                 

Точка пересечения спектральных кривых называется изобестической. На рис. 3 эта точка имеет абсциссу l*. Покажем, что в изобестической точке (при длине волны l*) оптическая плотность раствора, подчиняющегося условию (10), не зависит от состава раствора. По определению       

D_l = L(e_Am_A + e_Вm_В)                                 (11)

Исключая из уравнений (11) и (10) концентрацию  m_B, имеем

D_l = Le_Вm₀ + L(e_A – e_В)m_A                        (12)

Но в изобестической точке e_А = e_В, следовательно, = Le_Вm₀. Таким образом, не зависит от состава раствора.                     

Это означает также, что в изобестической точке пересекаются спектры растворов любого состава, подчиняющегося соотношению (10). Этот случай показан на рис. 4. Здесь А и В – спектры чистых компонентов, между ними лежат спектры растворов при 0 < m_A < m₀. Некоторые системы могут иметь несколько изобестических точек.

Наличие в спектрах изобестической точки облегчает анализ смесей. Если спектральная кривая одного из рабочих растворов не проходит через такую точку, то это может указывать либо на неправильное приготовление растворов (m_A + m_B № 0), либо на то, что при изменении состава среды изменяются значения экстинкций e_A и e_В (нарушение закона Бера).

Выбор характеристической длины волны, на которой проводится анализ, производят исходя из следующих соображений.

Во-первых, точность анализа смеси тем выше, чем больше значение производной . Согласно (12)

 = L (e_A – e_В).                         (13)

Следовательно, при заданной толщине кюветы L чувствительность растет с увеличением разницы |e_A – e_В|, достигая в некоторых точках максимального значения. На рис. 3 это длины волн l₂ и l₃.

Кроме того, не рекомендуется работать на крутом спаде спектральной кривой, например, в точке l₁ (рис. 3), поскольку в этом случае небольшие отклонения в значениях l, связанные, например, с неточностью установки длины волны, могут привести к заметной ошибке в значении D_l и неправильному определению.

Исходя из этого, в качестве характеристической длины волны выбирают l₂ или l₃, и анализ смесей проводят в этих точках спектра.

Согласно закону Бера отношение D/L должно быть постоянной величиной для данного вещества. Однако в силу конструктивных особенностей спектрофотометров и фотоэлектроколориметров постоянство D/L наблюдается только в среднем интервале оптических плотностей, примерно при 0,1 < D < 1,2 – 1,4. Следовательно, измерения нужно проводить в этой области величин D. Из этого условия подбирают кювету и концентрацию раствора.

Уже отмечалось, что работу начинают с проверки закона Бера. С этой целью исследуют растворы при различных концентрациях m. График D = D(m) должен изображаться прямой, проходящей через нуль (рис. 5).

1.7. Определение степени диссоциации слабой кислоты 

по спектрофотометрическим  данным

Анализ кислотно-основных равновесий представляет одну из наиболее важных областей приложения спектрофотометрии и колориметрии.

Вода и водные растворы некоторых сильных минеральных кислот и щелочей не поглощают свет в видимой и УФ-областях спектра. Это обстоятельство значительно упрощает применение спектрофотометрии к анализу кислотно-основных равновесий.

Рассмотрим реакцию

         (14)