Определение кинетических параметров ферментативного окисления глюкозы кислородом (Лабораторная работа К-32), страница 2

Общим недостатком данной теории является её ограниченная применимость. Всё вышесказанное справедливо только для начальных скоростей реакций. Кроме того, существуют аллостерические ферменты. Кинетика химических реакций с их участием отличается от кинетики ферментативных реакций Михаэлиса-Ментен.

Свойства глюкозы

Глюкоза с точки зрения химика представляет соединение, в котором присутствуют свойства альдегида и многоатомного спирта, и относится к классу углеводов. Природным сахаром является D-глюкоза. Её L-аналог получен синтетически. Отличие между ними заключается во вращении плоскости поляризованного света в разные стороны (D – вправо, L - влево).

В растворе реализуется сложное равновесие между разными конформациями молекулы. Открытой формы в смеси, как правило, очень немного, значительно преобладают две циклические – α и β. В зависимости от растворителя из раствора кристаллизуется либо α (H₂O, CH₃OH; угол вращения +112°), либо β (C₅H₅N, CH₃COOH; угол вращения +19°) формы [4].

β

α

Глюкоза легко окисляется по первому атому углерода (показано стрелкой).

Ферментативное окисление глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы.

В данной работе перед нами стояла задача определить максимальную скорость и константу Михаэлиса для реакции ферментативного окисления глюкозы. Побочным продуктом реакции окисления β-D-глюкозы является пероксид водорода.

O2 воздуха

-H2O2

глюкозооксидаза

Для измерений нами была использована методика, описанная в [5]. Скорость реакции может быть рассчитана, если известно изменение концентрации реагента или продукта за некоторое время. Определение концентрации растворённого вещества можно осуществить спектрофотометрическим методом, если вещество поглощает в данной области спектра и его сигнал можно идентифицировать среди прочих.

В нашей работе определение концентрации проводилось косвенным путём за счёт реакции продукта окисления глюкозы H₂O₂ с иодидом калия. При этом по умолчанию считалось, что вторая реакция протекает намного быстрее, чем анализируемая, и отсутствуют побочные реакции восстановления пероксида водорода.

Смешение реагентов проходило непосредственно в кювете прибора. В качестве фона использовали буферный раствор с pH=6.00, приготовленный из однозамещённого фосфорнокислого калия KH₂PO₄.

Методика эксперимента состояла в том, что выделяющийся в реакции окисления глюкозы пероксид водорода вводили в реакцию с раствором иодида калия:  Образующийся анион  имеет интенсивный максимум поглощения при 350 нм, который регистрируется спектрофотометром. На приборе установили длину волны 2860см^-1, что соответствует частоте ≈8,58*10¹⁴ Гц, или длине волны 350нм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Растворы реагентов.

Раствор KH₂PO₄ был приготовлен растворением навески 1.7063г в 200мл воды. Значение pH раствора отрегулировали посредством pH-метра, добавляя по каплям водный раствор NaOH. Приготовленный раствор количественно перенесли в мерную колбу на 250,0 мл, довели до метки водой и использовали в качестве буферного в эксперименте.

Раствор иодида калия приготовлен растворением навески 0,8295г в 8мл буфера. К полученному раствору добавили 2 мл 9% раствора молибдата натрия Na₂MoO₄. Был получен раствор иодида калия с концентрацией 0,4997моль/л.

Раствор β-D-глюкозы был приготовлен навески 1,0002г в 10мл буфера. Концентрация раствора 0,5556 моль/л.

Эксперимент.

В кварцевую кювету спектрофотометра длиной 1см вносили заданные количества реагентов, потом добавляли раствор глюкозооксидазы (10мкл), перемешивали и записывали график интенсивности поглощения от времени.

Каждый опыт повторяли не менее двух раз для получения правильных результатов и уменьшения случайной ошибки. После этого изменяли концентрацию β-D-глюкозы (субстрата) в пробе и вновь проводили измерения.

Прибором регистрировалась увеличение оптической плотности во времени, что говорило об увеличении концентрации  в анализируемом растворе. Изменение концентрации поглощающего вещества можно рассчитать согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра из изменения оптической плотности раствора. . Величина коэффициента экстинкции  на данной длине волны была нам известна (2,5*10⁴ л/(моль*см)). Из величины временной развёртки (4,4мин) было определено время каждого опыта, что позволило рассчитать скорость превращения. Среднюю скорость определяли как среднее арифметическое результатов каждого опыта. В таблице приведена скорость ферментативной реакции в расчёте на 1мкл фермента.

Результаты занесли в таблицу.

Таблица 1