Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение фруктозы. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом), страница 2

Занятие 3. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом.

Приборы и материалы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  3 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  термостат (37°С);

5)  мерные колбы;

6)  центрифуга;

7)  мерные пробирки на 10 мл;

8)  глюкоза;

9)  пипетки на 1 и 5 мл;

10) депротеинирующий реактив (0,2 М хлорнокислый литий в 0,9%-ном растворе хлористого натрия;

11) ферментативный реагент, содержащий: 9 ед. акт. глюкозооксидазы, 0,7 ед. акт. пероксидазы, 1 ммоль 4-аминоантипирина, 0,0076 ммоль фенола в 1 мл 0,1 мМ фосфатного буфера рН 7,0. (Растворы 10 и 11 – из набора реактивов «Новоглюк» ЗАО «Вектор-Бест»).

Экспериментальная часть

            Обезглавить крысу. Стекающую кровь собрать в пробирку с депротеинирующим реактивом (из расчета 5 мл депротеинерующего реактива на 0,5 мл крови). Полученный раствор быстро перемешать стеклянной палочкой и перелить в центрифужную пробирку. Центрифугировать 10 мин при 2000 об/мин. Супернатант аккуратно перенести пипеткой в чистую пробирку.

            Для построения калибровочной кривой в мерной колбе приготовить раствор глюкозы с концентрацией 12 ммоль/л. Далее из него получить растворы с концентрациями 3 ммоль/л, 6 ммоль/л и 9 ммоль/л.

            Приготовленные растворы глюкозы разбавить точно так же, как и кровь (исключая процедуру центрифугирования), но вместо депротеинирующего реактива использовать дистиллированную воду. Для этого в четыре пробирки внести по 5 мл воды и 0,5 мл соответствующего раствора глюкозы.

            Для определения концентрации глюкозы в шесть пробирок внести по 3 мл ферментативного реагента, поместить их в термостат (37°С) на 5 мин, затем в четыре из них добавить по 0,3 мл разбавленного, как описано выше, раствора глюкозы (для построения калибровочной кривой). В пятую пробирку добавить  0,3 мо  полученного из крови супернатанта, в шестую – 0,3 мо воды (контрольная проба). Растворы перемешать и выдержать в течение 25 мин при 37°С.

             По истечении времени измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 490 нм, кювета 3 мм). Окраска стабильна в течение 1 часа.

Номер раствора	Концентрация глюкозы, ммоль/л	Оптическая плотность
1	3	0,12
2	6	0,15
3	9	0,22
4	12	0,33
5	?	0,0775
6 (контроль)	0	0,0725

По полученным данным построить калибровочную кривую в координатах: оптическая плотность-концентрация глюкозы в ммоль/л. Используя кривую, найти концентрацию глюкозы в крови крысы.

Калибровочная кривая

Используя калибровочную кривую, найти концентрацию глюкозы в крови крысы. Она составила 0,6 ммоль/л.

Занятие 4. Количественное определение неорганического фосфата. Использование неорганического фосфата в метаболизме дрожжей

Приборы и материалы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  3 мм кюветы;

3)  пробирки химические – 10 шт.;

4)  термостат (37°С);

5)  ледяная баня (0°С);

6)  центрифуга;

7)  пробирки центрифужные – 4 шт.;

8)  секундомер;

9)  пипетки на 200 мкл, 1 мл и 5 мл;

10) стеклянная палочка.

Реактивы:

1)  сухие дрожжи;

2)  глюкоза;

3)  фосфатная смесь (60 мг Na2HPO4 • 12H2O + 20 мг KH2PO4 на 1 л Н2О)

4)  стандартный раствор фосфата 0,1 мМ (15,6 мг NaH2PO4 • 2H2O на 1 л Н2О);

5)  10%-ая трихлоруксусная кислота (ТХУ);

6)  1%-й раствор тритона Х-100;

7)  2,5%-й раствор молибдата аммония (2,5 г (NH4)6Mo7O24 • 4H2O в 100 мл 3М H2SO4).

Экспериментальная часть

а) Метаболизм дрожжей