4. Засеянные чашки Петри оставляют при комнатной температуре донышком вверх с тем, чтобы предупредить их случайное открывание при перестановке, а также чтобы исключить оседание конденсата, образующегося на крышке чашки Петри, на поверхность агаровой пластины.
· Определение числа клеток в накопленной культуре.
1. Через 7 суток определяют число микроорганизмов в исходной накопительной культуре, для чего сначала осуществляют подсчет выросших колоний.
2. Подсчет проводят, не открывая чашки Петри. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют.
3. Число клеток в 1 мл исследуемого субстрата определяют по формуле N=(Ax10n)/V , где N — количество клеток в 1 мл; A — среднее число колоний при высеве данного разведения; 10 — коэффициент разведения; n — порядковый номер разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии, взятый для посева, в мл.
Метод истощающего штриха
1. Из колоний, выросших на одной из чашек Петри, необходимо выбрать одну, растущую изолированно. Затем с помощью стерильной бактериологической петли взять небольшое количество бактериальной массы из выбранной колонии, слегка к ней прикасаясь. Необходимо внимательно следить за тем, чтобы не задеть близлежащие колонии.
2. Петлю культуры «расштриховывают». Для этого метода важно, чтобы петля не оставляла царапин на агаре.
3. После посева чашки оставляют при комнатной температуре крышкой вниз и выдкрживают в течение 7 суток.
Окрашивание по Грамму
1. На одно предметное стекло наносят рядом три мазка микробов:
- грамположительный контроль (S. ureae);
- грамотрицательный контроль (E.coli);
- образец
2. Мазки высушивают и фиксируют.
3. Препарат окрашивают кристаллвиолетом в течение 1 мин. Промывают.
4. Препарат протравливают раствором Люголя в течение 1 мин, промывают и тщательно высушивают.
5. Стекло заливают спиртом. Как только обесцветится контрольный грамотрицательный мазок (15-45 сек), препарат промывают водой.
6. В течение 1-2 мин препарат докрашивают фуксином.
Определение способности бактерий к спорообразованию
Пастеризация (тест на эндоспору)
1. Готовят 2 суспензии (0,5 мл физиологического раствора и достаточное количество биомассы):
а) из заведомо спорообразующей культуры (Sporosarcina ureae) — положительный контроль;
б) из иследуемой культуры.
2. Чашку Петри с МПА делят на 4 сектра: 2 сектора вверху — контроль (К) и опыт (О) до пастеризации; 2 сектора внизу — контроль (К') и опыт (О') после пастеризации.
3. В центр секторов К и О вносят по капл суспензии а и б.
4. После этого пробирки с бактериальными суспензиями строго вертикально переносят в водяную баню и нагревают в течение 10 минпри 80оС или 15 мин при 75оС.
5. По истечении времени пастеризации пробирки вынимают из водяной бани, хорошо встряхивают и вносят по капле бактериальной суспензии в сектор К' и О'. Чашку Петри оставляют на неделю при комнатной температуре.
Определение потребности бактерий в кислороде
В пробирку, заполненную на ½ высоты МПА уколом вносят изучаемый микроорганизм. Бактерий хорошо размешивают в среде. Через 7 дней проводят учет результатов теста.
Каталазная активность
Каталаза разлагает перекись водорода с образованием килорода в соответствии с реакцией: 2Н2О2 = О2 + 2Н2О. Культуру суспендируют в капле 3%-й перекиси водорода. Выделение О2, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о наличии в клетках каталазы.
Отношение к концентрации хлористого натрия, кислотности среды и температуре
Бактерии высевают в 2 мл
1. питательного бульона (рН 5,5), содержащего 5% хлорида натрия, для проверки влияние повышенной концентрации солей на рост микроорганизмов.
2. Питательного бульона с рН 5,5 и 9,6.
На чашку Петри высевают бактерии. Затем помещают чашку в холодильник на +4оС.
Результаты и обсуждения
В ходе тестирования установили, что определяемая культура использует энергию химических связей, следовательно, относится к хемоорганотрофам.
Клетки являются грамположительными палочками.
Культура спорообразующая. Таким образом, по ключу (с. 24-25 ) доходим до пункта ІІ.Б.2.гг.дд.е — Спорообразующие грамположительные палочки. Согласно определителю, микроорганизмы принадлежат к семейству Bacillace. Поскольку установлено, что бактерии — строгие аэробы, образуют каталазу, выделенную культуру отнесли к роду Bacillus (Клетки палочковидные, прямые или почти прямые. Большинство подвижно. Образуют термоустойчивые эндоспоры. Спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе.
Реакция по Граму положительная, по крайней мере на ранних стадиях развития, или отрицательная. Хемоорганотрофы. Метаболизм строго дыхательный, строго бродильный или/и дыхательный и бродильный одновременно, с использованием различных субстратов. Конечным акцептором электронов в дыхательном метаболизме служит молекулярный кислород, который для некоторых видов может быть заменен нитратами. Большинство видов образуют каталазу. Строгие аэробы или факультативные анаэробы). Так же выделенная культура растет при низких температурах, на питательном бульоне, содержащем 5% хлорида натрия и на питательном бульоне с рН 5,5 и 9,6.
Концентрация клеток в культуре, высеянной из разведения в 104 раз составляет 7, 025х107.
Вывод: выделенная культура Bacillus sp.
Список литературы:
1. Краткий определитель бактерий Берге: Пер. С англ. / Под ред. Дж. Хоулта и др. М. : Мир, 1980.
2. Выделение и идентификация микроорганизмов-нефтедестректоров. Титрование нитчатых бактериофагов методом агаровых слоев по Грациа. / А.А. Ильичев и др. НГУ, 2009
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.