Визначення бактерій групи кишкових паличок

Лабораторно-практичне заняття №16.

 Мікробіологічне дослідження м’яса птиці та продуктів з нього

Мета заняття: Ознайомитись із схемою та методами мікробіологічного дослідження м’яса птиці та продуктів з нього.

Завдання: 1. Ознайомитись з методами визначення загальної кількості бактерій м’яса птиці та продуктів з нього. 2.Провести дослідження м’яса птиці та продуктів з нього. 3.  Ознайомитися з вимогами по мікробіологічним показникам щодо м’яса птиці та виробів з нього.

Обладнання та матеріали. Проби м’яса птиці та продуктів з нього, колби,  пробірки, піпетки, мірні циліндри на 100 та 200 мл, робочі розчин реактивів, живильні середовища.

Довідковий матеріал.

Визначення бактерій групи кишкових паличок

Метод базується на висіві відповідної кількості продукту або змивів з його поверхні, їх розведень у рідкі лактозовмісні середовища та культивування їх при 37ºС протягом 48 год, підтвердження належності вирослих мікроорганізмів за морфологічними ознаками та зброджування лактози з утворенням кислоти і газу до бактерій групи кишкової палички.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок грунтується на посіві в агаризовані диференційні середовища проб, що містять в 1 г продукту більше 150 КУО або в 1 мл змиву більше 15 КУО бактерій групи кишкової палички.

Проведення досліджень. Із продукту або його змивів у пробірки із середовищем Кеслера з поплавками проводиться посів із відповідних розведень. Посіви інкубують при 37ºС і через 24 год їх проглядають. Позитивна реакція проявляється помутнінням середовища, зміною кольору з фіолетового на жовто-зелений з наявністю бульбашок газу в поплавках. При відсутності газоутворення реакцію вважають сумнівною. Висновки роблять через 48 год.

З метою підтвердження належності мікроорганізмів, які виросли на середовищі Кеслера  до бактерій групи кишкових паличок, проводять пересів штрихом на поверхню середовища Ендо і культивують при 37ºС протягом 24-х год.

На середовищі Ендо бактерії групи кишкових паличок утворюють червоні, рожеві, блідо-рожеві колонії з металевим блиском або без нього. Із вирослих колоній готують мазки і фарбують їх за Грамом.

Результати вважають позитивними при виявленні в посівах навіть однієї колонії з ознаками бактерій групи кишкових паличок.

Для виявлення бактерій групи кишкових паличок дозволяється використовувати рідкі лактозовмісні середовища (Хейфеца або бульйон із лактозою з брильянтовим зеленим і жовчю). Для пересівів дозволяється використовувати середовище Левіна. Бактерії групи кишкових паличок на середовищі Левіна утворюють блискучі чорні або темні з чорним центром, або ж бузкові з темним центром колонії.

При визначенні кількості бактерій групи кишкових паличок посівом на агаризоване середовище, по 0,1 або 0,2 мл розведення продукту або змиву з нього наносять на поверхню двох паралельних чашок із середовищем Ендо. Посіви інкубують при 37ºС протягом 24-х год. Відбирають чашки, на яких виросло від 15 до 150 характерних колоній. Не менше 5 колоній використовують для мікроскопії і пересіву на рідкі лактозовмісні середовища для підтвердження їх належності до бактерій групи кишкової палички.

При визначенні кількості бактерій групи кишкових паличок методом НІЧ (найбільш імовірного числа) висівають три послідовні 10-кратні розведення продукту або змиву з нього. Кожне розведення у триразовій повторності висівають у пробірки з одним із рідких лактозовмісних живильних середовищ. Співвідношення між кількістю посівного матеріалу і живильного середовища – 1: 9. Посіви культивують при 37ºС протягом 24-х год, а потім пересівають на середовище Ендо.

Оцінка результатів. Результати оцінюють за кожною пробою окремо. При виявленні грамнегативних неспорових паличок, які зброджують лактозу з утворенням кислоти і газу, роблять висновок про те, що виділені мікроорганізми належать до бактерій групи кишкових паличок.

Результати записують так: бактерії групи кишкових паличок виявлені, в якій наважці, у грамах або об’ємі змиву в мл, або площі змиву в см2.

При визначенні кількості бактерій групи кишкових паличок посівом в агаризоване середовище, підрахунок мікроорганізмів проводять за ДОСТом Р 50396.І (п.3.2), при посіві в рідкі живильні середовища – за ДОСТом 10444.3.

Дослідження на сальмонели

Метод базується на висіві відповідної кількості продукту або змивів з його поверхні на рідкі неселективні і селективні живильні середовища з виділенням чистих культур із морфологічними і культуральними ознаками сальмонел, перевірці біохімічних властивостей виділених культур та їхніх антигенних властивостей.

Проведення досліджень. Для отримання бактеріальних культур наважку продукту масою не менше 25 г або змиву (не менше 25 мл) висівають у пептонно-буферну воду у співвідношенні 1: 5. Посіви інкубують при 37оС протягом 16–24 год. Потім 10 мл культури із пептонно-буферної води пересівають у 90 мл одного із середовищ накопичення (Мюллера, Кауфмана, селенітове). Посіви культивують при 37С протягом 24–48 год.

Через 24 год із середовищ накопичення пересівають на середовище Ендо, Левіна або інші. Посіви культивують при 37ºС протягом 24-х год.

Сальмонели на середовищах Ендо і Плоскірєва ростуть у вигляді безбарвних колоній, на середовищі Левіна – голубуватих, на вісмутосульфітному агарі – чорних колоній із пофарбуванням середовища під колонією в чорний колір (S. typhi і деякі інші на вісмутосульфітному агарі ростуть у вигляді безбарвних або світло-зелених колоній).

При відсутності підозрілих колоній на диференційних середовищах дослідження припиняють. Підозрілі колонії використовують для подальших досліджень.