Глютатион пероксидаза: принцип работы. Глютатион перексидаза катализирует окисление GSH в GSSG перекисью водорода

Страницы работы

3 страницы (Word-файл)

Содержание работы

                                        Глютатион  пероксидаза

          Принцип работы. Глютатион перексидаза катализирует окисление  GSH  в  GSSG   перекисью водорода:

                                                                     GSH  peroxidase

                             2GSH   + Н2О2  ----------------------GSSG     + Н2О

 В этой   пробе,скорость образования  восстановленного глютатиона     измеряется как значение  восстановленного  глютатиона

                                                                         GR

                     GSSG  +   NADPH   +  H+  ----------------------2GSH     +    NADP+   

Окисленный   NADFH   определяется при 340нм. ( измеряется).

 Азид натрия добавляется в реакционную смесь для инактивации каталазы, которая  разрушает перекись водорода.

Феррицианид-цианидный раствор использовался для приготовления гемолизата, чтобы уменьшить взаимодействие между  Нb  и NADFH. Хотя такое взаимодействие не будет количественно значимым в отсутствие красителя, но при его использовании  получают более линейные  результаты.

          Процесс работы:

Реагенты  вносятся в кюветы с критическим  объемом меньше, чем 1 мл.

 При большом числе проб, реагенты добавляются в кюветы в количествах :

                                                              Фон ( пустышка)            проба

КРО4 буфер, рН 7.0, 1 М                           100                               100

GSH , 0.1 М                                                   ---                                 10

EDTA. 02 M ( нейтр)                                    20                                 20

Глютатион редуктаза, 10 Y/мл                  100                               100

Натрий азид,  0.4М                                       10                                  10

NADFH, 2мМ                                              100                                100

1 : 20 феррицианид- цианид гемолизат       20                                 20

Н2О                                                               640                               630

Проводят преинкубацию при 37 градусах  в течение 10 минут, затем добавляют

Перекись водорода Н2О2  10мМ                  10                                 10

    Добавляют  один  V эритроцитов к 19 V  раствора, содержащего 100 мг NaCN  и 300мг  K3(FeCN)6  в 1 литре.   

    Измеряют  оптическую плотность ( ОD)  0.9мл   при разведении 1:10  одномолярного фосфатного буфера, рН 7.0 при 230 нм ( ОD1). Добавляют  0.1 мл  при 1: 100 разведении  30%  раствора перекиси водорода и измеряют  ОD2.  Поскольку  мМ коэффициент  экстинкции    перекиси водорода при 230 нм -- - 0.071, то концентрация  ( С)  перекиси при  разведении  раствора 1 :100 будет равна :

 141 ( OD1—OD2)  мМ.  10 мМ разведение  получают,   растворяя  1 мл, разведенного  1:100 раствора  в 10 мл  воды ( С/  10мл)

   Снижение ОD системы  измеряют против пустышки при 340 нм.

  Дополнительные требования к  фону ( пустышке ). Раствор  феррицианид- цианида  необходим для  коррекции неферментативного  окисления  GSH  и Н2О2. .Эта величина  будет  приблизиьельно на уровне  0.015  к 0.02 OD  единиц / мин.

  Комментарии

 Трис- солянокислый буфер , рН 8, который  используется для большинства других  ферментов, не может использоваться  здесь  т.к повторяется фоновый сигнал. Скорость реакции сильно зависит от концентрации перекиси водорода.. 10 мМ  перекись  должна готовиться ежедневно из 30%  раствора. Рстворы глютатиона должны быть свежими, но даже и в таком состоянии они  всегда содержат некоторое количкство   окисленного глютатиона. Это результат действия NADFH. Если  глютатион содержит много окисленный формы, то никаких изменений  не будет отмечаться при добавлении перекиси, или они быстро исчезают после появления..  В этом случае  нужен более чистый  раствор  восстановленного глютатиона, или  дополнительное добавление   NADFH  опытную пробу.

                 Вычисления,  нормальные значения и интерпретация результатов.

Фоновое значение  должно  вычитаться из  значений в присутствии гемолизата. Один моль  NADFH   окисляется  с уменьшением  каждой молекулы перекиси.

  Содержание  этого фермента  повидимому будет ниже  у АСD,  красных клеток, чем у красных клеток крови , собранных в присутствии ЭДТА или гепарина.Красные клетки здорового взрослого человека, собранные при АСD  содержат 5.32 +--1.79  IY  глютатион пероксидаза/ г Нb ( значение +- стандаротное отклонение ). Недостаток глютатион пероксидазы  наблюдается при   неспецифической гемолитической  анемии. Предполагалось, что низкий уровень этого фермента, в красных клетках новорожденных ,   имеет значение при развитии   гемолитической анемии у новорожденных.

                                                      Глютатион    редуктаза

Глютатион редуктаза  катализирует  восстановление  окисленного   GSSG   NADFH  и  NADH  в восстановленную форму  GSH.

      NADFH ( NADH)  + H+    +   GSSG -------------  NADP+  ( NAD ) + GSH

Активность фермента определяется  спектрофотометрически  при 340 нм  при последующем окислении.  Глютатион редуктаза ( GR) является  флавиновым ферментом, было найдено, что он не полностью активируется  FAD   в здоровых гемолизатах. Полная активация апофермента требует преинкубации фермента с FAD. Это должно быть сделано перед добавлением  GSH  или  NADFH   в реакционную систему. Снижение ОD  при 340 нм ( 37 градусах ) в системе  без FAD, измеряется против фона не содержащего FAD. Пробы с FAD  измеряются соответственно против фона, сод-го

FAD.

      Процедура:

                                                      без FAD                                                    с   FAD  

                                         фон( мкл)   проба ( мкл)                         фон( мкл)   проба( мкл)

трис-НСl, рН 8.0, 1М              50           50                                            50               50

EDTA, 0.2 М ( нейтр)             10           10                                            10               10

1 :  20 водный

гемолизат                                 10            10                                            10                10

вода                                         880          780                                          780              680

FAD. 10 мМ                             ---           ---                                           100              100

                                               Инкубация  при 37 градусах  10 минут 

GSSG, 0.033 М ( нейт)          ---           100                                            ---               100

                                               Инкубация при 37 градусах 10 минут

NADFH 2 мМ

(спектр.Стандартиз).               50          50                                            50                  50 

 Дополнительные требования к фону---   нет.

Фермент становится  более активным в первые несколько минут. 1 моль NADFH окисляется с уменьшеним каждого моля окисленного GSSG. (Используются приложения на стр 32.

 Ферментативная активность ( Е) – Y  (единиц)  рассчитывается на  на 1  г Hb крови.

                                              Е = 100* А /Нв   ( где А число единиц фермента в 1 мл, а Нв – конц.-я

в 100мл гемолизата.

     В случае   NAD и  NADF  ферментативных проб, в которых 1 моль кофермента окисляется или восстанавливается на каждый моль, потребляемого  S считают:

             А=   дельта ОD /6.22       *     Vc/Vн,

 Где дельта OD  изменение оптической плотности  в минуту при 340 нм., а  Vc  и  Vн   соответственно объемы кювет- Vн объем кюветы с гемолизатом.

   Эритроциты здорового человека  содержат    5.68 +-   1.52  IU GR/g Hb ( значение стандартных отклонений)  без ( FAD ),  и 7.44 +- 1.63  IU GR/g Hb с добавлением  FAD.

Низкая активность  GR    служит мерой  оценки недостатка   рибофлавина в питании.                

Похожие материалы

Информация о работе

Предмет:
Химия
Тип:
Конспекты лекций
Размер файла:
44 Kb
Скачали:
0